Разработка схемы идентификации возбудителя бурой гнили картофеля Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. и ее апробация в диагностической лаборатории

Актуальность. Исследование посвящено разработке схемы выявления и идентификации бактерии Ralstonia solanacearum возбудителя бурой гнили картофеля, входящего в комплекс видов Ralstonia solanacearum ( R. solanacearum, R. pseudosolanacearum, R. syzygii ). Данный патоген поражает свыше 200 видов растений, включая экономически значимые культуры (картофель, томат, перец, баклажан), и включен в список карантинных организмов, отсутствующих на территории Российской Федерации. Цель работы: создание и апробация схемы лабораторной диагностики R. solanacearum для фитосанитарного контроля подкарантинной продукции.

Материал и методика. Методы, использованные в работе: метод подготовки проб (экстракция в фосфатно-солевом буфере с центрифугированием), ПЦР-анализ (ПЦР-РВ с использованием праймеров RS-I-F/RS-II-R/RS-P и коммерческого набора, ПЦР с детекцией результатов электрофорезом с праймерами RS-1-F/RS-1-R (RS-3-R)). Результаты. Была разработана оптимизированная схема по идентификации и выявлению возбудителя бурой гнили. Схема апробирована на 242 образцах подкарантинной продукции (картофель, розы, пионы, бананы), поступивших в диагностическую лабораторию в 2025 году. Результаты показали отсутствие бактерий комплекса R. solanacearum в образцах из Российской Федерации и выявили 14 случаев заражения клубней картофеля из импортных партий. При идентификации положительных образцов с помощью видоспецифичных праймеров RS-1-F/RS-1-R подтверждено присутствие R. solanacearum (sensu stricto).

Заключение. Ложноположительных и ложноотрицательных реакций в ходе апробации всех использованных тестов в рамках разработанной схемы зафиксировано не было, что свидетельствует об их 100% специфичности в рамках исследования. Итогом работы стало создание надежного алгоритма лабораторного исследования, обеспечивающего быструю и точную диагностику карантинного фитопатогена, что позволяет гарантировать фитосанитарную безопасность и соответствие продукции требованиям импортеров. 

1. Drenova N.V., Ignatieva I.M., Kondratiev M.O., Shneyder Ye.Yu. Validation of PCR tests with Russian kits for the detection of Ralstonia solanacearum sensu lato in plant extracts. Plant Health and Quarantine. 2022;1(9):2-20. (In Russ.) https://doi.org/10.69536/j3225-4992-5329-t

2. Tsuchiya K., Horita M. Genetic Diversity of Ralstonia solanacearum in Japan. Bacterial Wilt Disease. 1998:61-73. https://doi.org/10.1007/978-3-662-03592-4_9

3. Champoiseau P.G., Jones J.B., Allen C. Ralstonia solanacearum race 3 biovar 2 causes tropical losses and temperate anxieties. Plant https://doi.org/10.1094/PHP-2009-0313-01-RV

4. Sharma K., Iruegas-Bocardo F., Abdurahman A., Alcalá-Briseño R.I. et al. Ralstonia Strains from Potato-Growing Regions of Kenya Reveal Two Phylotypes and Epidemic Clonality of Phylotype II Sequevar 1 Strains. Phytopathology. 2022;112(10):2072-2083. https://doi.org/10.1094/PHYTO-11-21-0455-R

5. Villa J.E., Tsuchiya K., Horita M., Natural M. et al. Phylogenetic relationships of Ralstonia solanacearum species complex strains from Asia and other continents based on 16S rDNA, endoglucanase, and hrpB gene sequences. Journal of General Plant Pathology. 2005;71(1):3946. https://doi.org/10.1007/s10327-004-0156-1

6. Xiao Z., Li G., Yang A., Liu Z. et al. Comprehensive genome sequence analysis of Ralstonia solanacearum gd-2, a phylotype I sequevar 15 strain collected from a tobacco bacterial phytopathogen. Frontiers in Microbiology. 2024;(15):1335081. https://doi.org/10.3389/fmicb.2024.1335081.

7. Paudel S., Dobhal S., Alvarez A. M., Arif M. Taxonomy and Phylogenetic Research on Ralstonia solanacearum Species Complex: A Complex Pathogen with Extraordinary Economic Consequences. Pathogens. 2020;9(11):886.

8. doi:10.3390/pathogens9110886

9. Jiang G., Wei Z., Xu J., Chen H. et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Front Plant Sci. 2017;(8):1549. https://doi.org/10.3389/fpls.2017.01549

10. Shneyder Ye.Yu., Drenova N.V., Karimova Ye.V. Quarantine bacterial diseases of Ralstonia species for the Russian Federation. Plant Health and Quarantine. 2021;(3):10-26. (In Russ.) https://doi.org/10.69536/FKR.2021.55.68.001

11. Safni I., Cleenwerck I., De Vos P., Fegan M. et al. Polyphasic taxonomic revision of the Ralstonia solanacearum species complex: proposal to emend the descriptions of Ralstonia solanacearum and Ralstonia syzygii and reclassify current R. syzygii strains as Ralstonia syzygii subsp. syzygii subsp. nov., R. solanacearum phylotype IV strains as Ralstonia syzygii subsp. indonesiensis subsp. nov., banana blood disease bacterium strains as Ralstonia syzygii subsp. celebesensis subsp. nov. and R. solanacearum phylotypes I and III strains as Ralstonia pseudosolanacearum sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2014;64(9):3087-3103. https://doi.org/10.1099/ijs.0.066712-0

12. Westenberg M., de Haan E.G. Whole genome characterization of strains belonging to the Ralstonia solanacearum species complex and in silico analysis of TaqMan assays for detection in this heterogenous species complex. European Journal of Plant Pathology. 2021;159(3):593-613. https://doi.org/10.1007/s10658-020-02179-7

13. Paudel S., Dobhal S., Alvarez A. M., Arif M. RSSC-Lineage Multiplex PCR Assay Detects and Differentiates Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum, R. syzygii, and the R3bv2

14. Subgroup. PhytoFrontiers. 2024;4(1):64-76. https://doi.org/10.1094/PHYTOFR-06-23-0079-R

15. Karim Z., Hossain M.S., Begum M.M. Ralstonia solanacearum : A threat to potato production in Bangladesh. Fundamental and Applied Agriculture. 2018;3(1):407-421. https://doi.org/10.5455/faa.280361

16. Kumar J.S., Umesha S., Prasad K.S., Niranjana P. Detection of quorum sensing molecules and biofilm formation in Ralstonia solanacearum. Current Microbiology. 2016;72(3):297–305.

17. https://doi.org/10.1007/s00284-015-0953-0

18. EFSA Panel on Plant Health. Pest categorization of the Ralstonia solanacearum species complex. EFSA Journal. 2019;17(2):28. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2019.5618

19. Blom N.I., Gorkink-Smits P.P., Landman N.M., van de Bilt J.L. et al. Ralstonia solanacearum (phylotype II) isolated from Rosa spp. in the Netherlands is closely related to phylotype II isolates from other sources in the Netherlands and is virulent on potato. European Journal of Plant Pathology. 2024;171:445-458. https://doi.org/10.1007/s10658-024-02960-8

20. European and Mediterranean Plant Protection Organization. EPPO Standard PM 7/21 (3) Ralstonia solanacearum, R. pseudosolanacearum and R. syzygii ( Ralstonia solanacearum species complex). EPPO Bulletin. 2022;52(2):225-261.

21. https://doi.org/10.1111/epp.12837

22. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. 2024. https://doi.org/10.1101/pdb.rec108514

23. Weller S.A., Elphinstone J.G., Smith N.C., Boonham N. et al. Detection of Ralstonia solanacearum Strains with a Quantitative, Multiplex, Real-Time, Fluorogenic PCR (TaqMan) Assay. Applied and Environmental Microbiology. 2000;66(7(:2853-2858. https://doi.org/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000

24. Mazurin E.S., Kopina M.B., Sherokolava N.A. Quality control of phytosanitary diagnostic results obtained using molecular methods. RUDN Journal of Agronomy and Animal Industries. 2012;(3):31-37. (In Russ.)