Оценка встречаемости условно-патогенных бактерии в пасленовых растениях в защищенном грунте методом секвенирования нового поколения (NGS)

Актуальность. В последние годы отмечается резкий рост числа случаев заболеваний человека и животных, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами. Сельскохозяйственные растения служат одним из естественных резервуаров таких патогенов. Механизмы поражения растений схожи с механизмами патогенности бактерий человека и животных. По мере изучения экологии патогенных бактерий, были получены данные, однозначно показывающие возможность их длительного выживания и размножения, без признаков потери признаков вирулентности к организму основного хозяина.

Методология. Образцы растений томата и картофеля (39 шт.) были получены из 12 тепличных комбинатов и селекционных теплиц Московской области. Геномную ДНК и РНК выделяли с использованием соответствующих наборов. Для амплификации гипервариабельного V3-V4 участка гена 16S рибосомальной РНК использовались стандартные праймеры. Секвенирование проводили на платформе Illumina. Полученные данные секвенирования обрабатывались программой, написанной с использованием алгоритма QIIME 1.9.1. Был использован алгоритм классификации операционных таксономических единиц (ОТЕ) с открытым референсом (Open-reference OTU), порог отсечения при классификации 97%.

Результаты. В данной работе мы рассматриваем экспериментальные подтверждения латентного выживания условно-патогенных бактерий, используя как анализ метагенома бактериального сообщества на растениях в защищенном грунте и анализ популяции бактериофагов, что применяется в качестве индикатора присутствия целевых видов в окружающей среде.

1. Маркова Ю.А., Романенко А.С. Выделение условно-патогенных микроорганизмов из растений. Гигиена и санитария. 2006;(1):60-62. https://elibrary.ru/hstbdb

2. Худоярова Г.Н., Баротов И., Журакулов А.Г. Растения как возможные резервуары патогенных для человека бактерий. Евразийский журнал медицинских и естественных наук. 2023;(3):38–41.

3. Bankevich A., et al. SPAdes: A New Genome Assembly Algorithm and Its Applications to Single-Cell Sequencing. Journal of Computational Biology. 2012;5(19):455–477. https://doi.org/10.1089/cmb.2012.0021

4. Barbaree J.M., et al. Isolation of protozoa from water associated with a legionellosis outbreak and demonstration of intracellular multiplication of Legionella pneumophila. Applied and Environmental Microbiology. 1986;2(51):422–424. https://doi.org/10.1128/aem.51.2.422-424.1986

5. Bolyen E., et al. Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol. 2019;(37):852–857. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0209-9

6. Brandl M.T. Fitness of Human Enteric Pathogens on Plants and Implications for Food Safety. Annual Review of Phytopathology. 2006;1(44):367–392. https://doi.org/10.1146/annurev.phyto.44.070505.143359

7. Cruz A.T., Cazacu A.C., Allen C.H. Pantoea agglomerans, a Plant Pathogen Causing Human Disease. Journal of Clinical Microbiology. 2007;6(45):1989–1992.

8. Franz E., et al. Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium. Food Microbiology. 2007;1(24):106–112. https://doi.org/10.1016/j.fm.2006.03.002

9. Guo X., et al. Survival of Salmonellae on and in Tomato Plants from the Time of Inoculation at Flowering and Early Stages of Fruit Development through Fruit Ripening. Applied and Environmental Microbiology. 2001;10(67):4760–4764. https://doi.org/10.1128/AEM.67.10.4760-4764.2001

10. Gyaneshwar P., et al. Endophytic Colonization of Rice by a Diazotrophic Strain of Serratia marcescens. Journal of Bacteriology. 2001;8(183):2634–2645. https://doi.org/10.1128/jb.183.8.2634-2645.2001

11. Hussain W., et al. Bacteriophage-based advanced bacterial detection: Concept, mechanisms, and applications. Biosensors and Bioelectronics. 2021;(177):112973.

12. Islam M., et al. Fate of Salmonella enterica Serovar Typhimurium on Carrots and Radishes Grown in Fields Treated with Contaminated Manure Composts or Irrigation Water. Applied and Environmental Microbiology. 2004;4(70):2497–2502. https://doi.org/10.1128/AEM.70.4.2497-2502.2004

13. Itoh Y., et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Present in Radish Sprouts. Applied and Environmental Microbiology. 1998;4(64):1532–1535. https://doi.org/10.1128/AEM.64.4.1532-1535.1998

14. King C.H., et al. Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination. Applied and Environmental Microbiology. 1988;12(54):3023–3033. https://doi.org/10.1128/aem.54.12.3023-3033.1988

15. Loukil A., et al. Decrypting the environmental sources of Mycobacterium canettii by high-throughput biochemical profiling. PLoS ONE. 2019;14(9):e0222078. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0222078

16. Parke J.L., Gurian-Sherman D. Diversity of the Burkholderia Cepacia Complex and Implications for Risk Assessment of BIological Control Strains. Annual review of phytopathology. 2001;1(39):225–258. https://doi.org/10.1146/annurev.phyto.39.1.225

17. Parson W., et al. Evaluation of next generation mtGenome sequencing using the Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM). Forensic Science International: Genetics. 2013;5(7):543–549. https://doi.org/10.1016/j.fsigen.2013.06.003

18. Roossinck M.J., Martin D.P., Roumagnac P. Plant Virus Metagenomics: Advances in Virus Discovery. Phytopathology®. 2015;6(105):716–727. https://doi.org/10.1094/phyto-12-14-0356-rvw

19. Starr M.P., Chatterjee A.K. The Genus Erwinia: Enterobacteria Pathogenic to Plants and Animals. Annual Review of Microbiology. 1972;1(26):389–426.

20. Valdivia R.H., Heitman J. Endosymbiosis: The Evil within. Current Biology. 2007;11(17):R408–R410. https://doi.org/10.1016/j.cub.2007.04.001

21. Wood D.E., Salzberg S.L. Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments. Genome Biology. 2014;3(15):R46. http://genomebiology.com/2014/15/3/R46

22. Zinniel D.K., et al. Isolation and Characterization of Endophytic Colonizing Bacteria from Agronomic Crops and Prairie Plants. Applied and Environmental Microbiology. 2002;5(68):2198–2208. https://doi.org/10.1128/AEM.68.5.2198-2208.2002

23. QIAGEN. QIAamp DNA Microbiome Kit [Электронный ресурс]. URL: https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translationalresearch/dna-rna-purification/dna-purification/microbial-dna/qiaamp-dnamicrobiome-kit.

24. QIAGEN. QIAamp Viral RNA Mini Kit [Электронный ресурс]. URL: https://www.qiagen.com/us/products/diagnostics-and-clinical-research/sample-processing/qiaamp-viral-rna-kits.

25. New England Biolabs. Taq 2X Master Mix [Электронный ресурс]. URL: https://www.neb.com/en-us/products/m0270-taq-2x-master-mix.

26. ЕвроГен. Набор для синтеза кДНК MINT [Электронный ресурс]. URL: https://evrogen.com/products/Mint/Mint.shtml.

27. Roche. KAPA HyperPlus Kit [Электронный ресурс]. URL: https://sequencing.roche.com/us/en/products/group/kapa-hyperplus-kits.html.

28. Illumina. MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycles) [Электронный ресурс]. URL: https://www.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/cluster-gensequencing-reagents/miseq-reagent-kit-v3.html.

29. NCBI. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool [Электронный ресурс]. URL: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/.

30. Никитинский Д.А., Никитинская Е.В., Игнатов А.Н. Метагеномный анализ фитопатогенных бактерий в растениях защищенного грунта. Фитосанитария. Карантин растений. 2024;S4-2(20):67.

31. Waugh W.F. Solanin. Journal of the American Medical Association. 1906;47(18):1479-82.