Технология укоренения удвоенных гаплоидов редиса европейского, полученных в культуре микроспор in vitro

Актуальность. Удвоенные гаплоиды (DH-растения), являются превосходным материалом для генетических исследований и селекции за счет полной гомозиготности. Род Rathanus в семействе Brassicaceae является самым не отзывчивым к технологии получения удвоенных гаплоидов с помощью культуры изолированных микроспор in vitro (IMC). Изучение причин нарушения корнеобразования у растений-регенерантов и отработка элементов этого этапа технологии, позволит значительно повысить эффективность IMC технологии для редиса европейского.

Методы. В исследование были включены три сортообразца из коллекции ФГБНУ «Федеральный научный центр овощеводства» (ФГБНУ ФНЦО): Тепличный Грибовский, Розово-красный с белым кончиком и Родос. В ходе экспериментов использовали стандартный протокол получения DH-растений с помощью IMC технологии в стандартном виде и с модификацией этапа укоренения. Для укоренения использовали твердую (агар 7 г/л) среду MS: безгормональная и MS с добавлением ИУК (в концентрациях 0,5; 1 и 2 мг/л) и жидкая питательная среда MSm с 0,1 мг/л кинетина. Концентрация сахарозы во всех средах составляла 20 г/л. Использовали три вида техники пересадки растительных эксплантов на агаризованную безгормональную среду MS: посадка микропобегов с погружением их базальной части на 2-3 мм в среду; посадка в лунку, сделанную в питательной среде с помощью пинцета в стерильных условиях; и посадка на поверхность среды без заглубления.

Результаты. В настоящем исследовании изучены особенности этапа укоренения растенийрегенерантов редиса европейского в условиях in vitro. Показано, что для успешного укоренения микропобегов редиса важна техника пересадки. Растительные экспланты необходимо высаживать строго на поверхность твердой безгормональной питательной среды MS без заглубления. Использование для индукции корнеобразования жидкой среды MSm с добавлением 0,1 мг/л кинетина в пробирках с мостиками из фильтровальной бумаги также показала высокую эффективность. Для растений, склонных к образованию корнеплодоподобных структур (КС) с вторичными опухолями (ВО), необходима многократная диссекция аномальных образований с последовательными пересадками. Модификация этапа укоренения микропобегов повысила процент успешной адаптации DH-растений в условиях in vivo с 0-14% до 9598%.

1. Asif M. Progress and Opportunities of Doubled Haploid Production. Springer. 2013. DOI 10.1007/978-3-319-00732-8_1.

2. Buzovkina I.S., Lutova L.A. Genetic collection of inbred lines of radish: history and prospects. Russian Journal of Genetics. 2007;(4):1411–1423.

3. Buzovkina, I. S., Kneshke, I., and Lutova, L.A. In vitro modeling of tumor formation in radish lines and hybrids. Genetika. 1993;29(6):1002–1008.

4. Chun C., Park H., Na H. Microspore-derived embryo formation in radish (Raphanus sativus L.) according to nutritional and environmental conditions. Hort. Environ. Biotechnol. 2011;52(5):530-535. DOI 10.1007/s13580-011-0080-1.

5. Custers J.B.M. Microspore culture in rapeseed (Brassica napus L.). In: Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (eds). Doubled Haploid Production in Crop Plants. 2003:185-186. https://doi.org/10.1007/978-94-017-1293-4_29

6. da Silva Dias J.C. Protocol for broccoli microspore culture. In: Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (eds). Doubled Haploid Production in Crop Plants. 2003:195-204. https://doi.org/10.1007/978-94-017-1293-4_30

7. Dodueva, I.E., Lebedeva, M.A., Kuznetsova, K.A., Gancheva, M.S., Paponova, S.S., Lutova, L.L. Plant tumors: a hundred years of study. Planta. 2020;251(4):82. doi:10.1007/s00425-020-03375-5

8. Domblides E.A., Shmykova N.A., Shumilina N.A., Zayachkovskaya T.V., Mineykina A.I., Kozar E.V., Ahramenko V.A., Shevchenko L.L., Kan L.Ju., Bondareva L.L., Domblides A.S. A technology for obtaining doubled haploids in microspore cultures of the Brassicaceae family (guidelines). Moscow: VNIISSOK Publ., 2016. (In Russ)

9. Dunwell J.M. Haploids in flowering plants: origins and exploitation. Plant Biotechnol. J. 2010;(8):377-424. DOI 10.1111/j.1467-7652.2009.00498.x.

10. Efroni I., Mello A., Nawy T., Ip P.L., Rahni R., Delrose N., Powers A., Satija R., Birnbaum K.D. Root regeneration triggers an embryo-like sequence guided by hormonal interactions. Cell. 2016;(165):1721–1733. [CrossRef] DOI: 10.1016/j.cell.2016.04.046

11. Ferrie A. Microspore culture of Brassica species. In: Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. (eds). Doubled Haploid Production in Crop Plants. 2003:205-215. https://doi.org/10.1007/978-94-017-1293-4_31

12. Forster B.P., Thomas W.T.B. Doubled haploids in genetics and plant breeding. In: Janick J. (Ed.). Plant Breeding Reviews. 2005;(25):57-88. https://doi.org/10.1002/9780470650301.

13. Gibbs D.J., Conde J.V., Berckhan S., Prasad G., Mendiondo G.M., Holdsworth M.J. Group VII ethylene response factors coordinate oxygen and nitric oxide signal transduction and stress responses in plants. Plant Physiology. 2015;(169):23–31. DOI: https://doi.org/10.1104/pp.15.00338

14. Han N., Kim S.U., Park H.Y., Na H. Microspore-derived embryo formation and morphological changes during the isolated microspore culture of radish (Raphanus sativus L.). Kor. J. Hort. Sci. Technol. 2014;32(3):382389. DOI 10.7235/hort.2014.13170.

15. Han N., Na H., Kim J. Identification and variation of major aliphatic glucosinolates in doubled haploid lines of radish (Raphanus sativus L.). Kor. J. Hort. Sci. Technol. 2018;36(2):302-311. DOI 10.12972/kjhst.20180030.

16. Il’ina, E.L., Dodueva, I.E., Ivanova, N.M. et al. The effect of cytokinins on in vitro cultured inbred lines of Raphanus sativus var. radicula Pers. with genetically determined tumorigenesis. Russian Journal of Plant Physiology. 2006;(53):514–522. https://doi.org/10.1134/S1021443706040133

17. Kozar E.V., Domblides E.A., Soldatenko A.V. Factors affecting DH plants in vitro production from microspores of European radish. Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2020;24(1):31-39. DOI 10.18699/VJ20.592

18. Lebedeva M.A, Tvorogova V.E., Vinogradova A.P., Gancheva M.A., Azarakhsh M., Ilina E.L., Demchenko K.N., Dodueva I.E., Lutova L.A. Initiation of spontaneous tumors in radish (Raphanus sativus): cellular, molecular and physiological events. Journal of Plant Physiology. 2015;(173):97-104. https://doi.org/10.1016/j.jplph.2014.07.030

19. Licausi F., Kosmacz M., Weits D.A., Giuntoli B., Giorgi F.M., Voesenek L. ACJ, Perata P., van Dongen J.T. Oxygen sensing in plants is mediated by an N-end rule pathway for protein destabilization. Nature. 2011;479(7373):419–422. DOI: 10.1038/nature10536

20. Liu J., Sheng L., Xu Y., Li J., Yang Z., Huang H., Xu L. WOX11 and 12 are involved in the first-step cell fate transition during de novo root organogenesis in Arabidopsis. Plant Cell. 2014;(26):1081–1093. [CrossRef] [PubMed] https://doi.org/10.1105/tpc.114.122887

21. Lutova L., Dodueva I. Genetic control of regeneration processes of radish plants in vitro: from phenotype to genotype. Bio. Comm. 2019;64(2):124–132. https://doi.org/10.21638/spbu03.2019.204

22. Maluszynski M., Kasha K.J., Forster B.P., Szarejko I. Doubled Haploid Production in Crop Plants: A Manual. Springer Science Business Media. 2003:141-150. DOI 10.1007/978-94-017-1293-4.

23. Masuda K., Kikuta Y., Okazava Y. A Revision of the Medium for Somatic Embryogenesis in Carrot Suspension Culture. J. Fac. Agr. Hokkaido Univ. 1981;(60):183-193.

24. Matveeva T.V., Frolova N.V., Smets R., Dodueva I.E., Buzovkina I.S., Van Onckelen H., Lutova L.A. Hormonal control of tumor formation in radish. Journal of Plant Growth Regulation. 2004;(23):37–43. https://doi.org/10.1007/s00344-004-0004-8

25. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia plantarum. 1962;15(3):473-497.

26. Narbut S.I. Genetic tumor generated during inbreeding in radish. Vestn. Leningr. Univ. 1967;(15):144–149. (In Russ)

27. Shukla V., Lombardi L., Iacopino S., Pencik A., Novak O., Perata P., Giuntoli B., Licausi F. Endogenous Hypoxia in Lateral Root Primordia Controls Root Architecture by Antagonizing Auxin Signaling in Arabidopsis. Molecular Plant. 2019;(12):538–551. https://doi.org/10.1016/j.molp.2019.01.007

28. Shumilina D., Kornyukhin D., Domblides E., Soldatenko A., Artemyeva A. Effects of Genotype and Culture Conditions on Microspore Embryogenesis and Plant Regeneration in Brassica rapa ssp. rapa L. Plants. 2020;9(2):278. doi: 10.3390/plants9020278

29. Takahata Y., Komatsu H., Kaizuma N. Microspore culture of radish (Raphanus sativus L.): influence of genotype and culture conditions on embryogenesis. Plant Cell Rep. 1996;16(3-4):163-166. DOI 10.1007/BF01890859.

30. Tuncer B. Callus formation from isolated microspore culture in radish (Raphanus sativus L.). J. Anim. Plant Sci. 2017;27(1):277-282.

31. Tyukavin, G.B., Shmykova, N.A., Mankhova, M.A. Cytological study of embryogenesis in cultured carrot anthers. Russian Journal of Plant Physiology. 1999;46(6):876–884. (In Russ)

32. Vjurtts T.S., Domblides E.A., Shmykova N.A., Fedorova M.I., Kan L.Ju., Domblides A.S. Production of DH-plants in culture of isolated microspore in carrot. Vegetable crops of Russia. 2017;(5):25-30. (In Russ.) DOI:10.18619/2072-9146-2017-5-25-30

33. Zhang G., Zhao F., Chen L., Pan Y., Sun L., Bao N., Zhang T., Cui C.X., Qiu Z., Zhang Y. Jasmonate-mediated wound signalling promotes plant regeneration. Nat. Plants. 2019;(5):491–497. [CrossRef] [PubMed] DOI: 10.1038/s41477-019-0408-x

34. Zhou W., Lozano-Torres J.L., Blilou I., Zhang X., Zhai Q., Smant G., Li C., Scheres B. A jasmonate signaling network activates root stem cells and promotes regeneration. Cell. 2019;(177):942–956.e14. [CrossRef] [PubMed] https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.03.006