Получение удвоенных гаплоидов Brassica purpuraria

Актуальность. Овощная культура Brassica rapa L. ssp. chinensis (L.) Hanelt var. purpuraria (L.H. Bailey) Hanelt (синонимы: Brassica campestris L. var. purpurea Bailey; Brassica rapa L. ssp. chinensis var. purpurea) в последние годы набирает популярность как объект генетико-молекулярных исследований и как овощное растение ввиду высокого содержания биологически активных веществ и хозяйственно ценных признаков. Эффективной технологии получения DH-растений для ускорения селекционного процесса у этой культуры еще не разработано, поэтому исследования в этой области актуальны.

Материалы и методы. В исследование включены два сортообразца из коллекции ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова» (ВИР): №1301(Китай) и №1357(Нидерланды). В ходе экспериментов использовали стандартный протокол получения DH-растений в культуре изолированных микроспор in vitro и протокол с добавлением нитрата серебра (AgNO3) в питательную среду для стимулирования индукции эмбриогенеза. Для определения плоидности растений-регенерантов использовали прямой подсчет хромосом в меристемных клетках и метод проточной цитометрии клеточных ядер.

Результаты. В результате исследования установлено, что эмбриогенез в культуре B. purpuraria возможен как при использовании стандартного протокола, так и с добавлением нитрата серебра, который положительно влияет на индукцию эмбриогенеза. Выход эмбриоидов варьировал в зависимости от генотипа индивидуального растения в пределах сортообразца. Максимальный выход эмбриоидов составил 40 эмбриоидов на чашку Петри. Обозначена основная проблема, возникающая на этапе регенерации: около половины растений-регенерантов оказались альбиносами и были нежизнеспособны. Показана высокая степень спонтанного удвоения хромосом в растениях-регенерантах. Всего было получено 38 растений-регенератов из сортообразца №1301. Выявлено, что у некоторых DH-растений при инбридинге проявляется самонесовместимость (4 шт), в то время как у остальных растений семенное потомство было получено. Созданный материал передан для генетических исследований и селекционной работы. 

1. Alexander H, Haasen P. Dislocations and Plastic Flow in the Diamond Structure. Solid State Physics. 1969;22:27-158.

2. Asif M. Progress and Opportunities of Doubled Haploid Production. Cham: Springer International Publishing. 2013.

3. Caredda S, Clement C. Androgenesis and albinism in Poaceae: influence of genotype and carbohydrates. Anther and Pollen: From Biology to Biotechnology. 1999;211–226.

4. Chen CC, Lin MH. Induction of rice plantlets from anther culture. Bot. Bull. Acad. Sin. 1976;17:18–24.

5. Chen X, Zhu Z et al. Glucosinolates in Chinese Brassica campestris Vegetables: Chinese Cabbage, Purple Cai-tai, Choysum, Pakchoi, and Turnip. Hort Science. 2008;43(2):571–574.

6. Chu, P. et al. iTRAQ-based quantitative proteomics analysis of Brassica napus leaves reveals pathways associated with chlorophyll deficiency. J. Proteomics. 2014;113,244–259.

7. Clapham D. Haploid Hordeum plants from anthers in vitro. Z. Pflanzenzucht. 1973;69:142−155.

8. Dunwell JM. Haploids in flowering plants: origins and exploitation. Plant Biotechnol J. 2010;8:377-424.

9. Ferrie AMR, Caswell KL. Isolated microspore culture techniques and recent progress for haploid and doubled haploid plant production. Plant Cell Tiss Org Cult. 2011;104:301–309.

10. Ferrie AMR. Microspore culture of Brassica species. Doubled haploid production in crop plants (Ed. M. Maluszynski et al.). Kluwer, Dordrecht. 2003:205-215.

11. Gao Y, Jia J, Cong J et al. Non-ionic surfactants improved microspore embryogenesis and plant regeneration of recalcitrant purple flowering stalk (Brassica campestris ssp. chinensis var. purpurea Bailey). In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant. 2019; p.1–8. https://doi.org/10.1007/s11627-019-10033-3

12. Genovesi AD, Magill CW. Improved rate of callus and green plant production from rice anther culture following cold shock. Crop Sci. 1979;19:662–664.

13. Guo N, Wu J, Zheng S et al. Anthocyanin profile characterization and quantitative trait locus mapping in zicaitai (Brassica rapa L. ssp. chinensis var. purpurea). Mol Breeding. 2015;35:113. https://doi.org/10.1007/s11032-015-0237-1

14. Haliloglu K, Baenziger PS. The effects of age and size of wheat (Triticum aestivum L.) anther culture-derived embryos on regeneration of green and albino plantlets. Israel J. Plant Sci. 2003;51:207–212.

15. Huang H. The relative efficiency of microspore culture and chromosome elimination as methods of haploid production in Hordeum vulgare L. Z. Pflanzenzucht. 1984;92:22–29.

16. Jahne A, Lorz H. Cereal microspore culture. Plant Sci. 1995;109:1–12.

17. Jahne, A., Lazzeri, P.A., Jager-Gussen, M., Lorz, H. Plant regenerationfrom embryonic cell suspensions derived from anther cultures of barley (Hordeum vulgare L.). Theor. Appl. Genet. 1991;82:74–80.

18. Kabir KMdR, Kwon S-W, Y-J Park and al. Application of Cobalt Chloride and Silver Nitrate for Efficient Microspore Culture of Brassica rapa ssp. Plant Tissue Cult. & Biotech. 2013;23(1):1-10.

19. Knudson S, Due IK, Anderson SB. Components of response in barley anther culture. Plant Breed. 1989;103:241–246.

20. Li G-H, Chen H-C, Liu J-L et al. A high-density genetic map developed by specific-locus amplified fragment (SLAF) sequencing and identification of a locus controlling anthocyanin pigmentation in stalk of Zicaitai (Brassica rapa L. ssp. chinensis var. purpurea). BMC Genomics. 2019;20:343. https://doi.org/10.1186/s12864-019-5693-2

21. Lichter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus. Z. Pflanzenphysiol. 1982;105:427-434.

22. Maluszynski M, Kasha KJ, Forster BP, Szarejko I. Doubled haploid production in crop plants: a manual. Kluwer Academic. 2003.

23. Moieni A, Sarrafi A. Genetic analysis for haploid-regeneration responses of hexaploidy-wheat anther cultures. Plant Breed. 1995;114:247–249.

24. Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures. Physiologia Plantarum, 1962;15:473–497.

25. Na H., Kwak J.H., Chun C. The effect of plant growth regulators, activated charcoal and AgNO3 on microspore derived embryo formation in broccoli (Brassica oleracea L. var. italica). Hort. Environ. Biotechnol. 2011;52(5):524- 529. https://doi.org/10.1007/s13580-011-0034-7

26. Pechan PM, Keller WA. Identification of potentially embryogenic microspores in Brassica napus. Physiol. Plant. 1988;74:377-384.

27. Smith HB. Photosynthetic pigmentation-variegations on a theme. Plant Cell. 1999;11:1–14.

28. Wang C, Li H, Li Y. Genetic characterization and fine mapping BrCER4 in involved cuticular wax formation in purple cai-tai (Brassica rapa L. var. purpurea). Mol Breeding. 2019;39:12. https://doi.org/10.1007/s11032-018-0919-6

29. Wang T, Li HX, Zhang J. Initiation and development of microspore embryogenesis in recalcitrant purple flowering stalk (Brassica campestris ssp. chinensis var. purpurea Hort.) genotypes. Scientia Horticulturae. 2009;121(4):419-424.

30. Wang TT, Li HX, Zhang JH et al. Isolated microspore culture and plant regeneration in purple flowering stalk (Brassica campestris ssp. chinensis var. purpurea Hort.). J. Wuhan Botanical Research. 2004;22(6):569-5712004.

31. Wang Y, He Y, Yang M et al. Fine mapping of a dominant gene conferring chlorophyll- deficiency in Brassica napus. Scientific Reports. 2016;6:31419.

32. Wuhan Bot. Res. 22: 569-571 (in Chinese with English summary).Biddington NL, Sutherland RA and Robinson HT. Silver nitrate increases embryo production in anther culture of Brussels sprouts. Ann. Bot. 1988;62:181-185.

33. Вюртц Т.С., Домблидес Е.А., Шмыкова Н.А., Федорова М.И., Кан Л.Ю., Домблидес А.С.. Получение DH-растений в культуре микроспор моркови. Овощи России. 2017;(5):25-30. https://doi.org/10.18619/2072-9146-2017- 5-25-30

34. Домблидес Е.А. и др. Технология получения удвоенных гаплоидов в культуре микроспор семейства капустные (методические рекомендации). Коллектив авторов. ВНИИССОК. М.: Изд-во ВНИИССОК. 2016.

35. Козарь Е.В., Домблидес Е.А., Солдатенко А.В. Получение удвоенных гаплоидов редиса в культуре микроспор in vitro. Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. 2018:123-125.

36. Козарь Е.Г. Биологическая активность вторичных метаболитов растений семейства Brassicaceae. Овощи России. 2011;1(10):46-53.

37. Козарь Е.Г., Кононков П.Ф., Гинс М.С., Байков А.А., Шестеперов А.А. Биологическая и антиоксидантная активность водяного кресса. Новые и нетрадиц. растения и перспективы их использования. Общерос. акад. нетрадиц. и редких растений (и др.). Москва. 2017:04-112.

38. Скапцов М.В., Смирнов С.В., Куцев М.Г., Шмаков А.И. Проблемы стандартизации в проточной цитометрии растений. Turczaninowia. 2016;19(3):120-122.