ЭМБРИОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР БРОККОЛИ

Изучен процесс эмбриогенеза и отработаны элементы технологии получения удвоенных гаплоидов брокколи B.  oleracea  L. convar. botrytis (L.) Alef. var. italica Plenck в культуре микроспор in vitro. Было выявлено, что успешное развитие эмбриоидов происходит из микроспор, изолированных из бутонов длиной 4 и 5 мм, где преимущественно содержатся микроспоры – на поздней вакуолизированной, пыльца – на ранней двухклеточной стадии развития. Оптимальным режимом температурной обработки является обработка 32°С в течение первых 2-х суток после введения в культуру. Эмбриоиды были получены из пяти образцов брокколи: Arcadia F₁, Everest, Green Valiant, Marathon F₁, Furio. Наибольший выход эмбриоидов был получен у образца Green Valiant, где он составил до 140 эмбриоидов на чашку Петри, а наименьший – у Furio (до 3 эмбриоидов/чашку Петри). Первые деления в культуре микроспор у всех образцов наблюдали уже на 2-3 сутки культивирования. Дальнейшее развитие эмбриоидов шло по двум направлениям – путем прямого развития или с образованием суспензороподобных структур. Эмбриоиды, содержащие суспензор, развивались медленнее, чем бессуспензорные. Мы наблюдали образование эмбриоида не только на дистальном (по отношению к микроспоре) конце суспензороподобной структуры, но и образование цепочки из эмбриоидов, а также все возможные близнецовые комбинации эмбриоидов. Было показано, что метод получения эмбриоидов в культуре микроспор in vitro может быть использован не только для получения удвоенных гаплоидных растений, но и служить моделью для фундаментальных исследований по изучению этапов развития зиготических эмбриоидов и суспензоров.

1. Эмбриология растений: использование в генетике, селекции, биотехнологии: [в 2 т.] / под ред. И. П. Ермакова. – М., Агропромиздат, 1990. Т. 2 / пер. с англ. Э. С. Терехина [и др.]. – 1990. – 461 с.

2. Шмыкова Н.А., Шумилина Д.В., Супрунова Т.П. Получение удвоенных гаплоидов у видов рода Brassica L. //Вавиловский журнал генетики и селекции. 2015;19(1):111-120. DOI:10.1134/S1062359015040135

3. Шумилина Д.В., Шмыкова Н. А., Бондарева Л. Л., Супрунова Т. П. Влияние генотипа и компонентов среды на эмбриогенез в культуре микроспор капусты китайской Brassica rapa ssp. сhinensis сорта Ласточка //Известия РАН, серия биологическая, 2015. № 4. С. 368–375. DOI:10.7868/S000233291504013X

4. Alexander M.P. Differential staining of aborted and nonaborted pollen. // Stain technol. 1969. V.44. №3.P.117-122.

5. Arnison P.G., Keller W.A. A survey of the anther culture response of Brassica oleracea L cultivars grown under field conditions. //Plant Breed.1990. V.104. P.125-133.

6. Asif M (2013), Progress and Opportunities of Doubled Haploid Production, SpringerBriefs in Plant Science 6, DOI 10.1007/978-3-319-00732-8_1

7. Baillie A.M.R., Epp D.J., Hutcheson D. and Keller W.A. In vitro culture of isolated microspores and regeneration of plants in Brassica campestris// Plant Cell Rep. 1992. V.11. P.234-237.

8. Chauvin J. E., Yang Q., Jeune B. Le., Herve Y. Odention d’embryons par culture d’anthtres chen le choufleur et le brocoli et evaluation des potentialites du materiel obtenu pour la creation varietale.// Agronomie, 1993. V.13. P.579-590.

9. Dias J.S. Effect of activated charcoal on Brassica oleracea microspore culture embryogenesis// Euphytica. 1999. P.108. V.65-69.

10. Dunwell J.M. (2010) Haploids in flowering plants: origins and exploitation. Plant Biotechnol. J., 2010, 8: 377-424 (doi: 10.1111/j.1467-7652.2009.00498.x).

11. Farnham M.W. Doubled-haploid broccoli production using anther culture effect of anther source and seed set characteristics of derived lines// J. Amer. Hort Sci. 1998. V.123. P.73-77.

12. Friml J., Vieten A., Sauer M., Weijers D., Schwarz H., Hamann T., Offringa R. & Jьrgens G. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis// Nature.2003. V.426. P. 147–153.

13. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrients requirements of suspension cultures of soybean root cells// Exp Cell Res. 1968. V.50. P.151–158.

14. Gu H.H., Hagberg P., Zhou W.J. Cold pretreatment enhances microspore embryogenesis in oilseed rape (Brassica napus L.). Plant Growth Regul. 2004;42:137-143

15. Kott L.S. Application of double haploid technology in breeding of oilseed Brassica napus// AgBiotech News Inf.1998. V. 10(3). P.69-74.

16. Lichter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus. Z. Pflanzenphysiol., 1982, 105: 427-434.

17. Maluszynski M, Kasha KJ, Forster BP, Szarejko I (2003) Doubled haploid production in crop plants: a manual. Kluwer, Dordrecht

18. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 1962, 15: 473-497

19. Pechan P.M., Keller W.A. Identification of potentially embryogenic microspores in Brassica napus// Physiol Plant.1988. V. 74. P. 377–384.

20. Prem et al.: A new microspore embryogenesis system under low temperature which mimics zygotic embryogenesis initials, expresses auxin and efficiently regenerates doubled-haploid plants in Brassica napus. BMC Plant Biology 2012 12:127 DOI:10.1186/1471-2229-12-127.

21. Supena E.D.J. Innovations in microspore embryogenesis in Indonesian hot pepper (Capsicum annuum L.) and Brassica napus L. // Ph.D. thesis Wageningen University, Wageningen, The Netherlands. 2004. PP 131.

22. Supena EDJ, Winarto B, Riksen T, Dubas E, van Lammeren A, Offringa R, Boutilier K, Custers J. Regeneration of zygotic-like microspore-derived embryos suggests an important role for the suspensor in early embryo patterning. J Exp Bot. 2008;59:803–814. DOI:10.1093/jxb/erm358

23. Takahata Y., Keller W.A. (1991) High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore of Brassica oleracea L. Plant Sci,74:235-242.

24. Takahata Y., Takany Y., Kaisuma N. Determination of microspore population to obtain high frequency embryogenesis in broccoli (Brassica oleracea L.). // Plant Tiss Cult Lett. 1993. V.10. P.49-53.

25. Telmer C.A., Simmonds D.H., Newcomb W. Determination of developmental stage to obtain high frequencies of embryogenic microspores in Brassica napus// Physiol Plant.1992. V.84. P.417-424.

26. Yeung E.C. and Meinke D.W. Embryogenesis in angiosperms: development of the suspensor// Plant Cell. 1993. V.5. P.1371-1381.