ovoshchiОвощи РоссииVegetable crops of Russia2072-91462618-7132Федеральный научный центр овощеводства10.18619/2072-9146-2018-1-3-7ovoshchi-469Research ArticleСЕЛЕКЦИЯ И СЕМЕНОВОДСТВО СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙBREEDING AND SEED PRODUCTION OF AGRICULTURAL CROPSЭМБРИОГЕНЕЗ В КУЛЬТУРЕ МИКРОСПОР БРОККОЛИEMBRYOGENESIS IN CULTURE OF ISOLATED MICROSPORE OF BROCCOLIДомблидесЕ. А.DomblidesE. A.

кандидат с.-х. наук, зав. лабораторией биотехнологии

Ph.D. in Agriculture, Head of Laboratory of Biotechnology

Edomblides@mail.ruКозарьЕ. В.KozarE. V.

м.н.с. лаборатории биотехнологии, аспирант

Junior Researcher, Laboratory of Biotechnology, Postgraduate Student

Edomblides@mail.ruШумилинаД. В.ShumilinaD. V.

кандидат биологических наук, с. н. с.

Ph.D. in Biology, Senior Researcher in Laboratory of Biotechnology

Edomblides@mail.ruЗаячковскаяТ. В.ZayachkovskayaT. V.

кандидат с.-х. наук, с.н.с.

Ph.D. in Agriculture, Senior Researcher in Laboratory of Biotechnology

Edomblides@mail.ruАхраменкоВ. А.AkhramenkoV. A.

кандидат техн. наук, н.с.

Ph.D. in Technical Sciences, Researcher in Laboratory of Biotechnology

Edomblides@mail.ruСолдатенкоА. В.SoldatenkoA. V.

доктор с.-х. наук, врио директора

Doctor of Sciences in Agriculture, Acting Director

Edomblides@mail.ruФГБНУ «Федеральный научный центр овощеводства»РоссияFSBSI Federal Scientific Vegetable CenterRussian Federation2018260320180137Copyright © Домблидес Е.А., Козарь Е.В., Шумилина Д.В., Заячковская Т.В., Ахраменко В.А., Солдатенко А.В., 20182018Домблидес Е.А., Козарь Е.В., Шумилина Д.В., Заячковская Т.В., Ахраменко В.А., Солдатенко А.В.Domblides E.A., Kozar E.V., Shumilina D.V., Zayachkovskaya T.V., Akhramenko V.A., Soldatenko A.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.vegetables.su/jour/article/view/469

Изучен процесс эмбриогенеза и отработаны элементы технологии получения удвоенных гаплоидов брокколи B.  oleracea  L. convar. botrytis (L.) Alef. var. italica Plenck в культуре микроспор in vitro. Было выявлено, что успешное развитие эмбриоидов происходит из микроспор, изолированных из бутонов длиной 4 и 5 мм, где преимущественно содержатся микроспоры – на поздней вакуолизированной, пыльца – на ранней двухклеточной стадии развития. Оптимальным режимом температурной обработки является обработка 32°С в течение первых 2-х суток после введения в культуру. Эмбриоиды были получены из пяти образцов брокколи: Arcadia F1, Everest, Green Valiant, Marathon F1, Furio. Наибольший выход эмбриоидов был получен у образца Green Valiant, где он составил до 140 эмбриоидов на чашку Петри, а наименьший – у Furio (до 3 эмбриоидов/чашку Петри). Первые деления в культуре микроспор у всех образцов наблюдали уже на 2-3 сутки культивирования. Дальнейшее развитие эмбриоидов шло по двум направлениям – путем прямого развития или с образованием суспензороподобных структур. Эмбриоиды, содержащие суспензор, развивались медленнее, чем бессуспензорные. Мы наблюдали образование эмбриоида не только на дистальном (по отношению к микроспоре) конце суспензороподобной структуры, но и образование цепочки из эмбриоидов, а также все возможные близнецовые комбинации эмбриоидов. Было показано, что метод получения эмбриоидов в культуре микроспор in vitro может быть использован не только для получения удвоенных гаплоидных растений, но и служить моделью для фундаментальных исследований по изучению этапов развития зиготических эмбриоидов и суспензоров.

 

The process of embryogenesis and technological experimental protocol has been studied and applied to produce doubled haploid plants from microspore cultured in vitro in broccoli B. oleracea L. convar. botrytis (L.) Alef. var. italica Plenck. It was shown that successful embryoid development occurred from microspore isolated from buds 4-5 mm long, containing microspores at late vacuolated stage and pollen grain at twocell stage. The optimal temperature of treatment was 32 Cᵒ within 2 days after culture was launched. The embryoids were produced from the following broccoli accessions: Arcadia F1, Everest, Green Valiant, Marathon F1, and Furio. The highest embryoid yield was obtained from accession Green Valiant, and consisted of 140 embryoids per Petri dish, whereas the lowest yield was in Furio, up to 3 embryoids per Petri dish. The first microspore division was observed in all accessions in 2-3 days of cultivation. Further development of embryoids went either directly into usual embryoid or into suspensor-like structures. The embryoids with suspensor developed more slowly than embryoids without one. We observed the embryoid formation not only at distal end towards microspore originated the suspensor-like structure but also the formation of chain of embryoids, and all variation of twin embryoid combinations. The study of process of embryogenesis in isolated microspores in vitro showed that this method can be used both to produce doubled haploid plants and study the developmental stages of zygotic embryos and suspensors.

эмбриогенезкультура микроспорDH-растениясуспензороподобные структурыброкколиmicrospore embryogenesisculture of isolated microsporesDH-plantssuspensor-like structuresbroccoliReferencesЭмбриология растений: использование в генетике, селекции, биотехнологии: [в 2 т.] / под ред. И. П. Ермакова. – М., Агропромиздат, 1990. Т. 2 / пер. с англ. Э. С. Терехина [и др.]. – 1990. – 461 с.Embryology of Angiosperms: use in genetics, breeding, biotechnology: [in 2 volumes] / edited by I. P. Ermakov. - M., Agropromizdat/ translation from English E.S. Terekhina [and others]. 1990. V.2. 461 p.Шмыкова Н.А., Шумилина Д.В., Супрунова Т.П. Получение удвоенных гаплоидов у видов рода Brassica L. //Вавиловский журнал генетики и селекции. 2015;19(1):111-120. DOI:10.1134/S1062359015040135Shmykova N.A., Shumilina D.V., Suprunova T.P. Doubled haploid production in Brassica L. seeds.// Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii – Vavilov Journal of Genetics and Breeding. 2015;19(1):111-120.Шумилина Д.В., Шмыкова Н. А., Бондарева Л. Л., Супрунова Т. П. Влияние генотипа и компонентов среды на эмбриогенез в культуре микроспор капусты китайской Brassica rapa ssp. сhinensis сорта Ласточка //Известия РАН, серия биологическая, 2015. № 4. С. 368–375. DOI:10.7868/S000233291504013XShumilina D.V., Shmykova N.A., Bondareva L.L., Suprunova T.P. Effect of genotype and medium culture content on microspore-derived embryo formation in Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. chinensis) cv. Lastochka. //Biology Bulletin. 2015. V.42. № 4. P.302-309.Alexander M.P. Differential staining of aborted and nonaborted pollen. // Stain technol. 1969. V.44. №3.P.117-122.Alexander M.P. Differential staining of aborted and nonaborted pollen. // Stain technol. 1969. V.44. №3.P.117-122.Arnison P.G., Keller W.A. A survey of the anther culture response of Brassica oleracea L cultivars grown under field conditions. //Plant Breed.1990. V.104. P.125-133.Arnison P.G., Keller W.A. A survey of the anther culture response of Brassica oleracea L cultivars grown under field conditions. //Plant Breed.1990. V.104. P.125-133.Asif M (2013), Progress and Opportunities of Doubled Haploid Production, SpringerBriefs in Plant Science 6, DOI 10.1007/978-3-319-00732-8_1Asif M (2013), Progress and Opportunities of Doubled Haploid Production, SpringerBriefs in Plant Science 6, DOI 10.1007/978-3-319-00732-8_1Baillie A.M.R., Epp D.J., Hutcheson D. and Keller W.A. In vitro culture of isolated microspores and regeneration of plants in Brassica campestris// Plant Cell Rep. 1992. V.11. P.234-237.Baillie A.M.R., Epp D.J., Hutcheson D. and Keller W.A. In vitro culture of isolated microspores and regeneration of plants in Brassica campestris// Plant Cell Rep. 1992. V.11. P.234-237.Chauvin J. E., Yang Q., Jeune B. Le., Herve Y. Odention d’embryons par culture d’anthtres chen le choufleur et le brocoli et evaluation des potentialites du materiel obtenu pour la creation varietale.// Agronomie, 1993. V.13. P.579-590.Chauvin J. E., Yang Q., Jeune B. Le., Herve Y. Odention d’embryons par culture d’anthtres chen le choufleur et le brocoli et evaluation des potentialites du materiel obtenu pour la creation varietale.// Agronomie, 1993. V.13. P.579-590.Dias J.S. Effect of activated charcoal on Brassica oleracea microspore culture embryogenesis// Euphytica. 1999. P.108. V.65-69.Dias J.S. Effect of activated charcoal on Brassica oleracea microspore culture embryogenesis// Euphytica. 1999. P.108. V.65-69.Dunwell J.M. (2010) Haploids in flowering plants: origins and exploitation. Plant Biotechnol. J., 2010, 8: 377-424 (doi: 10.1111/j.1467-7652.2009.00498.x).Dunwell J.M. (2010) Haploids in flowering plants: origins and exploitation. Plant Biotechnol. J., 2010, 8: 377-424 (doi: 10.1111/j.1467-7652.2009.00498.x).Farnham M.W. Doubled-haploid broccoli production using anther culture effect of anther source and seed set characteristics of derived lines// J. Amer. Hort Sci. 1998. V.123. P.73-77.Farnham M.W. Doubled-haploid broccoli production using anther culture effect of anther source and seed set characteristics of derived lines// J. Amer. Hort Sci. 1998. V.123. P.73-77.Friml J., Vieten A., Sauer M., Weijers D., Schwarz H., Hamann T., Offringa R. & Jьrgens G. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis// Nature.2003. V.426. P. 147–153.Friml J., Vieten A., Sauer M., Weijers D., Schwarz H., Hamann T., Offringa R. & Jьrgens G. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis// Nature.2003. V.426. P. 147–153.Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrients requirements of suspension cultures of soybean root cells// Exp Cell Res. 1968. V.50. P.151–158.Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. Nutrients requirements of suspension cultures of soybean root cells// Exp Cell Res. 1968. V.50. P.151–158.Gu H.H., Hagberg P., Zhou W.J. Cold pretreatment enhances microspore embryogenesis in oilseed rape (Brassica napus L.). Plant Growth Regul. 2004;42:137-143Gu H.H., Hagberg P., Zhou W.J. Cold pretreatment enhances microspore embryogenesis in oilseed rape (Brassica napus L.). Plant Growth Regul. 2004;42:137-143Kott L.S. Application of double haploid technology in breeding of oilseed Brassica napus// AgBiotech News Inf.1998. V. 10(3). P.69-74.Kott L.S. Application of double haploid technology in breeding of oilseed Brassica napus// AgBiotech News Inf.1998. V. 10(3). P.69-74.Lichter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus. Z. Pflanzenphysiol., 1982, 105: 427-434.Lichter R. Induction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus. Z. Pflanzenphysiol., 1982, 105: 427-434.Maluszynski M, Kasha KJ, Forster BP, Szarejko I (2003) Doubled haploid production in crop plants: a manual. Kluwer, DordrechtMaluszynski M, Kasha KJ, Forster BP, Szarejko I (2003) Doubled haploid production in crop plants: a manual. Kluwer, DordrechtMurashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 1962, 15: 473-497Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 1962, 15: 473-497Pechan P.M., Keller W.A. Identification of potentially embryogenic microspores in Brassica napus// Physiol Plant.1988. V. 74. P. 377–384.Pechan P.M., Keller W.A. Identification of potentially embryogenic microspores in Brassica napus// Physiol Plant.1988. V. 74. P. 377–384.Prem et al.: A new microspore embryogenesis system under low temperature which mimics zygotic embryogenesis initials, expresses auxin and efficiently regenerates doubled-haploid plants in Brassica napus. BMC Plant Biology 2012 12:127 DOI:10.1186/1471-2229-12-127.Prem et al.: A new microspore embryogenesis system under low temperature which mimics zygotic embryogenesis initials, expresses auxin and efficiently regenerates doubled-haploid plants in Brassica napus. BMC Plant Biology 2012 12:127 DOI:10.1186/1471-2229-12-127.Supena E.D.J. Innovations in microspore embryogenesis in Indonesian hot pepper (Capsicum annuum L.) and Brassica napus L. // Ph.D. thesis Wageningen University, Wageningen, The Netherlands. 2004. PP 131.Supena E.D.J. Innovations in microspore embryogenesis in Indonesian hot pepper (Capsicum annuum L.) and Brassica napus L. // Ph.D. thesis Wageningen University, Wageningen, The Netherlands. 2004. PP 131.Supena EDJ, Winarto B, Riksen T, Dubas E, van Lammeren A, Offringa R, Boutilier K, Custers J. Regeneration of zygotic-like microspore-derived embryos suggests an important role for the suspensor in early embryo patterning. J Exp Bot. 2008;59:803–814. DOI:10.1093/jxb/erm358Supena EDJ, Winarto B, Riksen T, Dubas E, van Lammeren A, Offringa R, Boutilier K, Custers J. Regeneration of zygotic-like microspore-derived embryos suggests an important role for the suspensor in early embryo patterning. J Exp Bot. 2008;59:803–814. DOI:10.1093/jxb/erm358Takahata Y., Keller W.A. (1991) High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore of Brassica oleracea L. Plant Sci,74:235-242.Takahata Y., Keller W.A. (1991) High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore of Brassica oleracea L. Plant Sci,74:235-242.Takahata Y., Takany Y., Kaisuma N. Determination of microspore population to obtain high frequency embryogenesis in broccoli (Brassica oleracea L.). // Plant Tiss Cult Lett. 1993. V.10. P.49-53.Takahata Y., Takany Y., Kaisuma N. Determination of microspore population to obtain high frequency embryogenesis in broccoli (Brassica oleracea L.). // Plant Tiss Cult Lett. 1993. V.10. P.49-53.Telmer C.A., Simmonds D.H., Newcomb W. Determination of developmental stage to obtain high frequencies of embryogenic microspores in Brassica napus// Physiol Plant.1992. V.84. P.417-424.Telmer C.A., Simmonds D.H., Newcomb W. Determination of developmental stage to obtain high frequencies of embryogenic microspores in Brassica napus// Physiol Plant.1992. V.84. P.417-424.Yeung E.C. and Meinke D.W. Embryogenesis in angiosperms: development of the suspensor// Plant Cell. 1993. V.5. P.1371-1381.Yeung E.C. and Meinke D.W. Embryogenesis in angiosperms: development of the suspensor// Plant Cell. 1993. V.5. P.1371-1381.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.